公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：Hi T7 高產(chǎn) RNA 合成試劑盒可在體外高效合成多種類 型的 RNA 如 mRNA、lncRNA、shRNA 等。利用 Hi T7 RNA 聚合酶識別 T7 promoterTTCTAATACGACTCACTATAG G）以方框中 G 堿基為起點開始轉(zhuǎn)錄，該試劑盒可以從少量 樣本得到高效轉(zhuǎn)錄，單次反應(yīng)可獲得高達 150-200 μg 的產(chǎn) 物，轉(zhuǎn)錄長度可達 4000nt 以上。 利用該試劑盒得到的 RNA 適用于多種下游應(yīng)用，如 RNA 結(jié)構(gòu)和功能研究、核酸酶生物化學(xué)研究、RNase 保護 分析探針、印跡雜交、反義 RNA 及 RNAi 實驗、微陣列 分析、顯微注射、體外翻譯和 RNA 疫苗等。 Hi T7 高產(chǎn) RNA 合成試劑盒使用方便，使用優(yōu)化好的預(yù) 混液，有利于用戶快速建立反應(yīng)。本試劑盒還配備了 DNase I，在 RNA 合成完畢后可快速去除 DNA 模板，便于獲得高 純度轉(zhuǎn)錄 RNA。

組分：

(1) 2×Hi T7 Trans Solution 中包含反應(yīng) Buffer、rNTP。
(2) T7 Trans Enzyme Mix 中包含 Hi T7 RNA 聚合酶、
Rnase Inhibitor 等。
保存：
-20℃可保存 2 年，避免反復(fù)凍融。
操作步驟：
（1） 按以下組分配制反應(yīng)液
2×Hi T7 Trans Solution 10 μl
DNA（RNase Free） 0.5~1 μg
Hi T7 Trans Enzyme Mix 1.5 μl
RNase Free H2O upto 20 μl
（2）37℃反應(yīng) 4h，轉(zhuǎn)錄 RNA 產(chǎn)量在 120~200 μg。
（3） 轉(zhuǎn)錄完畢后，向反應(yīng)液中加入 2.5 μl 的 10xRD Buffer和 2 μl 的 RNase Free DNase I，37℃孵育 15min，以去除DNA 模板。
（4）整個反應(yīng)完畢后可取 0.05~0.1 μl 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行電泳檢測，并凍存于-80℃保存。選用 LiCl 沉淀純化或 5min RNAPurification Kit 進行轉(zhuǎn)錄 RNA 的純化，以去除鹽、rNTP、蛋白等。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：