公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

本品為全組分凍干品試劑，包含了標準反應緩沖液、HNB 染料、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行高效的恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及 RT-LAMP 擴增反應的試劑。優化的反應體系，確保快速的完成檢測試劑的反應體系建立。在 LAMP 擴增起始前 HNB 染料與 Mg2+結合表現出肉眼可見的紫羅蘭色，當陽性擴增發生時 Mg2+被 LAMP反應的副產物焦磷酸螯合，HNB 染料無法與 Mg2+結合表現出肉眼可見的天藍色。由此判斷天藍色為陽性擴增。該顯色方法受樣本緩沖鹽、pH 等影響較小，適用的樣本較pH 顯色法通用性更強。

儲存：-20℃保存 2 年；室溫（25℃）保存>6 個月。使用凍干微球進行全擴增體系用品的制備方法：將優化的擴增引物分裝于 0.2 ml EP 管底部，于 70-80℃條件烘干1-2h。烘干后的 0.2 ml EP 管已經含有干燥的擴增引物，再加入一粒凍干微球即可制備成全擴增體系干燥品，該干燥品無需冷鏈運輸，可長期保存。

反應體系說明：每一個凍干微球為按照 25 μl 反應體系建立，在使用時只需要加入 25 μl 的 ddH2O 或模板即可進行反應。
使用實例：
1. 配制反應體系
在 0.2 ml EP 反應管中加入下述試劑
Bst4.0 HNB Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到液體總量 25 μl
10xLAMP Primer Mix
濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 8 μM、F3/B3 分別為 2 μM
2. 反應體系配好后，置于65°C進行反應25~45min。肉眼觀察結果，天藍色為陽性，紫羅蘭色為陰性。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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